ピペット操作の向上に役立つ「ピペッティングハンドブック」

RAININ Pipetting 360° ピペット チップ 評価 選定 テクニック Natural sciGenecet l aBwes etxtpeerri eRncee s“luivel”t –learn easisly Your Quick Guide to Good Pipetting SchoolP iepexttpinegr Himanedbnotosk

目　次 １．はじめに　 4 ２．計画立案、ワークフロー及び選定 5 　計画立案とワークフロー ワークフローの分析 ワークフローの最適化 容量の範囲とスループット サンプル /試薬用の容器のフォーマット サンプル /アッセイ ３．最適なピペットの選定 14 　空気置換式ピペット 　ポジティブ式ピペット ワークフローの最適化 容量の範囲とスループット 電動シングルチャンネルピペット マルチチャンネルピペット ハイスループットピペッティングシステム 特殊ピペット ボジティブ式ピペット 連続分注器 ピペットコントローラー ボトルトップディスペンサー ４．最適なチップの選定 24 　デザイン 　品質 シールシステム LTS LiteTouchチップイジェクトシステム チップの選定 特殊用途チップ 2

目　次 ５．ピペットテクニック 30 　最適な容量設定 　浸漬深さ 　角度 　一貫性 　吐出 　チップのプリリンス 　温度変化の認識 　マイクロメーターの設定 ６．ピペット操作のリスク 40 3

1.はじめに ピペットの結果の精度はその性能に左右されます。ご使用のピ ペットは正確な量を吐出できていますか？ ピペットの定期的な点検は機能と精度の確保に役立ちますが、 ピペットの性能は扱い方に大きく影響されることをご存知でし たか？ Good Pipetting Practice(GPP) は、研究者の方々がより良い実験 結果を得るために、ピペットの選定、ピペットのテクニック、人 間工学のコンセプト、校正そして繰り返し作業についての考え をお伝えするものです。 ピペッティングはマイクロリッターやミリリッター単位の少量の 液体を測定したり移動させる作業ですが、実験室で最も一般的 に行われている実験です。そしてこの作業を迅速に正確に行う ことが、実験を成功させるために必要です。空気置換式のピペッ トは、その優れた特徴から、多くの実験で使用されています。 4

2. 計画立案、ワークフロー及び選定 計画立案とワークフロー 新しいプロジェクトは、綿密に計画されたプロセスから恩恵を 受けます。そこでは最大の効率とデータ生成のためにワークフ ロー内の全ての過程が分析されます。 これをリキッドハンドリングの観点からみると、サンプルの種類 を見極めることから、スループットまでに理解が求められます。 ピペットの使い方や、チューブやプレートといったフォーマット にも関わり、更には最適なピペット選定へも繋がります。このよ うに、ピペット、チップ、それらの取り扱い方は全て正確な最 終結果を得るための一連の過程とみることが出来ます。ピペッ トとチップの選定を適切に行い、正しい使い方を実践すること で、実験を計画し実行することが出来るのです。 ワークフローの分析 最初に、サンプルの準備から最後のデータ作成までの実験のす べてのステップを把握することが重要です。次に、データ作成 のために各過程における変動の許容範囲を確定することです。 ある実験や過程においては、他のそれらよりもより厳しく求めら れる場合があります。不適切なピペットや扱い方もこの変動を 大きくする要因になりかねません。 5

ワークフローの分析 ●変動の許容範囲を確定 ●変動する可能性が最も高いアプリケーションとステップの確定 - qPCR - 連続希釈 6

ワークフローの最適化 容量の範囲とスループット たいていのワークフローでは５mlや１０mlといった大容量の液 体を扱うことから始めます。そこでは高い精度を求められること はありません。しかし、その後の少量の液体を取り扱うプロセ スでは、高い精度が求められます。 大容量ピペットには異なる特性があるため、測定の早さと正確 性、精度のバランスはそれらを加味して取る必要があります。正 しい容量のピペットを選択する際の推奨ガイドラインとして、作 動範囲を全体の 35%～100%の間で設定することが挙げられ ます。例えば 1000μlのピペットの有効測定範囲は 350μl～ 1000μlです。たとえこの大容量ピペットの最小仕様が 100μl で 0μlまで調整可能だとしても、利用者のテクニックにより差 異が発生するため、推奨最小値は 350μlになります。35%以 下の値を使用する際には、更に緻密なテクニックが必要とされ るためです。不適切な範囲で器具を使用することは、結果とし て正確性や精度を欠いてしまう恐れがあります。 7

ピペットの モデル 最小容量 最大容量 正確度 精密 正確度 精密 正確度 精密 種類 10% 10% 50% 50% 100% 100% MR-10 0.5 µL 10 µL 9% 3% 2% 0.60% 1.50% 0.60% ポジティブ式 MR-250 50 µL 250 µL 3% 0.60% 1.70% 0.30% 1% 0.20% MR-1000 100 µL 1000 µL 3% 1.60% 1% 0.50% 0.80% 0.40% L-10XLS 0.5 µL 10 µL 2.50% 1.20% 1.50% 0.60% 1% 0.40% 空気置換式 L-200XLS 20 µL 200 µL 2.50% 1% 0.80% 0.25% 0.80% 0.15% L-1000XLS 100 µL 1000 µL 3% 0.60% 0.80% 0.20% 0.80% 0.15% 正確度は、設定した容量にどれだけ近似した結果を出せ るかを示す指標です。一般的なピペットを最大容量の35％ 以上に設定した場合の、正確度は10％以下ですが、容量 を10％以下に設定した場合の正確度は３倍以上の誤差が 生じます。 精密度は、繰り返し性の指標です。一般的には正確度の 1/3から1/4程度です。 8

ピペットの モデル 最小容量 最大容量 正確度 精密 正確度 精密 正確度 精密 サンプル液の種類によってピペットを使い分けることが重要 種類 10% 10% 50% 50% 100% 100% です。 MR-10 0.5 µL 10 µL 9% 3% 2% 0.60% 1.50% 0.60% 下記の表はそれを示したものになります。 ポジティブ式 MR-250 50 µL 250 µL 3% 0.60% 1.70% 0.30% 1% 0.20% MR-1000 100 µL 1000 µL 3% 1.60% 1% 0.50% 0.80% 0.40% L-10XLS 0.5 µL 10 µL 2.50% 1.20% 1.50% 0.60% 1% 0.40% 空気置換式 サンプルの種類 容量 推奨ピペットL-200XLS 20 µL 200 µL 2.50% 1% 0.80% 0.25% 0.80% 0.15% 手動タイプ 電動タイプ L-1000XLS 100 µL 1000 µL 3% 0.60% 0.80% 0.20% 0.80% 0.15% 粘性、有機溶媒 20-50mL AutoRep S AutoRep E 非粘性、水溶液 20-50mL AutoRep S Pipet-X 粘性、有機溶媒 大容量 1-20mL AutoRep S AutoRep E 非粘性、水溶液 1-20mL Pipet-Lite XLS, Pipet-X, E4 XLS AutoRep S 粘性、有機溶媒 200-1000µL Pos-D, AutoRep S AutoRep E 非粘性、水溶液 中容量 200-1000µL Pipet-Lite XLS E4 XLS 粘性、有機溶媒 10-200µL Pos-D 非粘性、水溶液 少容量 10-200µL Pipet-Lite XLS E4 XLS 粘性、有機溶媒 マイクロリッター <10µL Pos-D 非粘性、水溶液 <10µL Pipet-Lite XLS E4 XLS サンプル数が多い場合や繰り返し作業が多い場合は、マルチ チャンネルピペットや96チャンネル専用のピペットを用いる ことが効率的です。 9

サンプル /試薬用の容器のフォーマット 96ウェルプレート作業では、サンプルや試薬をマイクロ チューブからプレートへ移すことや、反対にプレートから チューブへ移すことが頻繁に求められますが、中には 24ウェ ルから 96ウェルのような異なるフォーマット間への移動が 必要になることがあります。アジャスタブルスペーサーを用 いれば、この作業時間を最大で 85％短縮することが可能です。 アジャスタブルスペーサー 異なるフォーマットへの移動 ・マイクロチューブからプレートへ ・異なるフォーマットのプレートへ 10

サンプル /アッセイ 複雑で繰り返しの多いピペット作業は電動ピペットの利用が 有効です。電動ピペットは、特定のプロトコールに対してプ ログラムを組んで使うことが可能です。さらに、手動ピペッ トよりもより一貫した結果を得ることができます。何故なら、 ピペットを操作する際に、属人的な誤差を排除することがで きるからです。これは、連続希釈や qPCRのような作業にお いて顕著に表れます。 サンプルやアッセイにはそれぞれ独自の検討事項がありま す。例えば、ゲオノミクス関連のアプリケーションにおいて はフィルターチップを用いることで、サンプルやピペットに おける DNAコンタミネーションを防ぐことができます。フィ ルターがエアゾールをブロックしてシャフト内部へ汚染を防 ぎます。その結果、サンプルへの汚染も防げます。さらに、 微生物からの汚染、腐食及び塩付着を防ぎます。 電動ピペットの利点 ・複雑な操作と繰り返し作業 ・より精度の高い結果を求める実験（qPCR）など 11

BioClean製造―コンタミネーションフリー 研究室で高品質な結果を確保するには、チップは DNase、 RNase、DNA、パイロジェン、アデノシン三リン酸（ATP）によっ て汚染されていないことが求められます。レイニンは可能な 限り人との接触を排除することで、バイオクリーンな製造に 重点を置いています。レイニンのチップはクリーンなのです。 完璧な製造 -完璧なチップ形状 製造にバージンポリプロピレンと最先端の技術を採用するこ とで、完全無欠なレイニンチップが生まれます。変形、ひび 割れ、バリは存在しません。形状においても完璧なチップで す。 アプリケーションに応じて ・ D NAコンタミネーションやキャリーオーバーを防ぐために フィルターチップを使用しましょう。 ・ フ ィルターチップはピペット内部の汚染も防ぐことが出 来ます。 12

コンタミネーションを防止 　　疎水性フィルターが 　　交差汚染を防止 エアゾール 疎水性フィルターが汚染を防止 疎水性フィルターがエアゾールと液体に対してバリアを形成 し、ラボの結果に悪影響を与えかねないサンプル汚染を排除 します。 添加剤を含まない純粋なポリエチレンフィルター レイニンのエアゾール耐性チップで採用されているフィル ターは、焼結されたポリエチレン粒子で構成されています。 酵素反応を抑制する添加物を含む他のフィルターと異なり、 レイニンのフィルターは純粋なポリエチレンで作られていま す。焼結粒子は疎水性で、曲がりくねって経路マトリックス を形成し（平均的な孔径：40μm）、エアゾールや液体がピペッ ト本体へ吸収されるのを防止します。 13

３．最適なピペットの選定 精度や生産性が高いだけではなく、人間工学的に優れた様々 なピペットがあります。それらは、空気置換式とポジティブ 式ピペットに分類することができます。両タイプとも、ピス トンのサイズと移動距離によって容量設定をすることができ ます。 ピストン シャフト シャフト 空気相 ピストン チップ キャピラリー サンプル サンプル 図１　空気置換式とポジティブ式ピペット 14

空気置換式ピペット ・水溶液に最適 ・経済的 吸気置換式ピペットは実験室において最も一般的なピペット です。 先端にチップを取り付けて使用します。 プランジャーを操作することで、ピペット内部の空気相の圧 力と体積を変化させて液体を吸引します。 ポジティブ式ピペット ・あらゆる液体に対して正確に摂取可能 ・粘性、高密度、揮発性の高い液体に最適 空気置換式ピペットほどではありませんが、ポジティブ式ピ ペットも多くの場面で使われています。 使い捨てのピストンとキャピラリーを用います。 プランジャーを操作するとピストンが直接接触して液体を吸 い上げます。 ポジティブ式ピペットは粘度、高密度、揮発性が高い液体な どへの採取に適しています。 しかし、キャピラリーとピストンは一般的なチップよりも価 格が高いので空気置換式ピペットで同じ結果が得られるなら ば、空気置換式ピペットをお使い下さい。 15

ワークフローの最適化 容量の範囲とスループット ピストンが上 に動くと内部 空気相の圧力 が下がり、 大抵のワークフローでは 5mlや10mlと いった大容量の液体を扱うことから始め ます。 そこでは、高い精度を求められることは ありません。しかし、その後の少量の液 体を取り扱うプロセスでは、高い精度が 大気圧に押されて 求められます。 サンプルがチップ へ満たされます。 図２　 空気置換式ピペットの動き 16

そこで、まず適切なピペットを用いるガイ ドラインとして 35から100％の容量のレ ンジで使用されることをお勧めします。 すなわち、1000μｌのピペットを使用する 場合、350以上のレンジで使われること をお勧めします。 ピペットはそれ以下のレンジでも使用可能 ですが、少量の採取は使用者や使い方に 左右されます。 図３　手動ピペット 17

電動シングルチャンネルピペット 電動ピペットは 1980年代に登場しま した。手動ピペットの操作とは異なり、 吸引と吐出をマイクロプロセッサーで 制御します。電動ピペットを使用すれ ば、より精度が高く一貫性のある結果 を得られます。また、属人的なばらつ きも排除することが可能です。 レイニンの E4 XLSは、これまでのピペッ ティングのシンプルさとコントロール の概念を打ち破る、数々の特長や機能、 そしてナビゲーションに対する革新的 な新しいアプローチを備えています。 美しい輪郭の本体とバランス性、レイ ニンの定評ある精度と正確性を凝縮し た E4 XLSは、従来の製品とは一線を画 するピペッティングを実現します。ま た、E4 XLSはお客様の PCから更新・ 拡張が可能です。 図４　電動ピペット 18

マルチチャンネルピペット レイニンの新しい Pipet-Lite XLSマルチチャンネルは、市場に おいて最も技術的で人間工学的に優れた手動マルチチャンネ ルピペットです。特許取得済み LiteTouchT M System（LTS TM） テクノロジーを採用したマルチチャンネルピペットは迅速な 充填と、全チャンネルでより高精度で一貫性のあるサンプル ピックアップを実現します。最高品質の素材で堅牢に作られ ている当社のマルチチャンネルは、長年にわたって一貫性と 信頼性のある作業ができるように設計されています。そして、 すべての Pipet-Lite XLSモデルで実施されているとおり、内蔵 された RFIDタグにより高度な校正トラッキングが可能にな ります。 図５　マルチチャンネルピペット 19

リクイデーターが 96ウェルを重点 すばやく簡単に分注 卓上や層流キャビネット内にフィットし、手動ピペットと同 じ原理で 96ウェルに充填します。 電機やプログラミング、複雑なロボット装置は必要ありませ ん。リクイデーター 96は完全に持ち運び可能で、ラボと作 業台の間を簡単に移動できます。 図６ Liquidator 96卓上型ピペッティングシステム 20