【アプリケーションノート】タンパク質分析用FT-IRシステムCONFOCHECKによる軽水中のタンパク質の二次構造解析

Bruker Optics Application Note タンパク質分析用 FT-IRシステム CONFOCHECK による 軽水中のタンパク質の二次構造解析 はじめに 生体を構成する成分は、いずれも生命にとって重要な機 能を果たしており、その中でもタンパク質は多岐にわたる 働きを有するため、生命活動の仕組みを知る上で、その 基本的性質の研究が必要不可欠です。タンパク質の機能 と構造には非常に深い関連性があり、タンパク質が多様な 働きを発揮できるのは、それぞれに適した高次構造を取る ことができるためと考えられています。タンパク質の凝集 やフォールディング現象などは、アルツハイマー病、プリ オン病などの疾病にも関係を持つとされています。 赤外分光法を用いることで、タンパク質の二次構造の解 析が可能となります。タンパク質の二次構造を解析する代 表的な手法として、紫外可視域における円二色性（Circular Dichroism: CD）分光法が一般的に用いられていますが、 固体や懸濁液では測定ができない、分解能が低いなどの 問題があります。これに対して赤外分光法では、試料の状 態に影響されることなく、二次構造の定量的な解析や、折 り畳み、凝集などのプロセスの追跡が可能です。 タンパク質の二次構造の違いは、赤外スペクトルに おいて、図 1に示すように Amide I 吸収帯（1700 ～ 1600 cm-1）に反映されます。しかしながら、この波数領 図 1. タンパク質の二次構造の違いを反映する 　　 Amide I 赤外吸収帯（ 波数は各構造の平均的な値） 域は、タンパク質にとって重要な存在である水（軽水）に よる強い吸収と重なるため、とくに水溶液中のタンパク質 試料、分析システム について、その二次構造の僅かな変化を精度よく解析する 試料タンパク質としてリボヌクレアーゼ A（RNase A）を ためには、高い感度と広い測光ダイナミックレンジを併せ 用い、その軽水溶液を 10 μg / μlに調整しました。 持つ赤外分光計が求められます。 測定には、タンパク質水溶液分析用 ATRアクセサリー ブルカー・オプティクスの “CONFOCHECK” は、この “Bio-ATR II” を装着した CONFOCHECKを使用しまし ような要求に対応する FT-IR システムであり、軽水溶液中 た。この組み合わせは、水溶液中の微量タンパク質につい のタンパク質の定性および定量、二次構造の定量的解析、 て、環境変動に伴う二次構造の変化の分析に適しており、 さらには環境に依存した二次構造の変化に関する動的解 溶液の量も 20 μl 程度と少量で測定が可能です。ここでは、 析を可能にします。ここでは、CONFOCHECK による、 試料溶液20 μlを25 ℃から75 ℃の間を昇降温し（2℃間隔）、 タンパク質の二次構造の温度依存性に関する解析事例に 各温度での赤外スペクトルを連続的に測定することで、二 ついて紹介します。 次構造の変化とその可逆性に関する解析を行いました。

結果 図 2-aに、昇温過程におけるRNase Aの赤外スペクト ルのAmide I 吸収帯を示します（溶媒のスペクトルを差し 引いたデータ）。まず、昇温開始直後のAmide I吸収帯 においては、ピークトップが 1640 cm-1以下と比較的低い 波数にあることから、室温付近の軽水中におけるRNase A には、βシート構造が多く存在していることが分かりま す。続いて、昇温とともにこの構造が減少、70℃以上でほ ぼ崩壊し、これに代わって高波数側の吸収強度が増加し ていることが分かります。このことは、昇温により不規則 構造、あるいはそれに近い構造の比率が増加していること を示唆しています。これらの挙動は、各温度で測定したス ペクトルについて、初期状態（25℃）におけるスペクトルと の差分を求めることで、より明確に捉えることができます （図 2-b）。 さらに、各構造に帰属されるピークの強度変化を追跡す ることで、二次構造の温度依存性をより正確に理解するこ とが可能となります。そこで、試料温度に対して、βシート 構造と不規則構造に由来するそれぞれのピークについて積 分強度をプロットした結果を図2-c (beta sheet/1649 ~ 1610 cm-1および disordered structure/1700 ~ 1648 cm-1) に示 します。この結果から、RNase A は、昇温から降温の過 程において、可逆的に構造を変化させていることが確認で きます。これに加え、各ピークの強度から定量的な評価へ 展開することも可能になります。 まとめ この解析例が示すように、赤外分光タンパク質分析シス テムCONFOCHECKを用いることで、軽水溶液中におけ る微量タンパク質の二次構造の変化を解析することが可能 です。測定に必要な試料の量は 20 μlと微量であり、貴重 図2. 軽水中におけるRnase Aの赤外スペクトルの温度依存性 な試料についても高い精度で解析を行うことができます。 　　a)　昇温過程における赤外スペクトル 　　b)　昇温過程における赤外差スペクトル（25℃ との差分） ここでは、温度依存性に関する解析例を紹介しましたが、 　　c)　β シートおよび不規則構造に由来するピークの強度変化 CONFOCHECKは、pHやストレスなどの環境変化に伴 う変性の追跡や、リガンドとの相互作用の解析などにも応 参考文献 用することが可能であり、CD法等の他の手法と併用する Alexander Wittemann, Matthias Ballauff, Analytical ことで、タンパク質の高次構造に関するより詳細な知見が Chemistry, 76(10), (2004) 得られるものと期待できます。 Amanda S. Lee, Charles Galea et al, J. Mol. Biol. 327, 699 (2003) ブルカー・オプティクス株式会社 本社：〒104-0033 東京都中央区新川 1-4-1 住友不動産六甲ビル Phone：03-3523-6870 Fax: 03-3523-6871 大阪営業所：〒532-0004 大阪市淀川区西宮原 1-8-29 テラサキ第2ビル Phone：06-6394-8118 Fax: 06-6394-9003 www.bruker.jp Application Note AN-JP 3