マイコプラズマキットアプリケーションノート

マイクロザルトAMPマイコプラズマキットと 競合他社品2製品との比較 #09 Application Note #10 #11 #12 #13

Alexandra Scholz イントロダクション 実験および結果 (alexandra.scholz@sartorius.com) 世界最小の細菌であるマイコプラズマは この研究ではマイクロザルトAMPマイコ Stephanie Schweizer 独立繁殖が可能で、モリクテス網に属 プラズマキットと、サンプル調整キット (stephanie.schweizer@sartorius.com) し、寄生性で非常に生長が遅いことが知 であるマイコプラズマAMP抽出キット られています。細胞培養へのコンタミ （いずれもドイツ・ザルトリウスステ ネーションは今なお大きな問題となって ディムGmbH製）を、他社製のDNA抽出 おり、細胞培養にマイコプラズマが存在 キットおよびリアルタイムPCRでマイコ すると、数多くの生理学的・生化学的パ プラズマを検出するキット2種類と比較 ラメータが影響を受けます。マイコプラ しました。試験にはMycoplasma arginini ズマが感染すると、代謝や生長、生存 (NCTC code 10129), Mycoplasma orale 率、高分子合成能、形態などに変化が生 (NCTC code 10112)およびSpiroplasma じるので、細胞培養のコンタミネーショ citri (NCTC code 10164) の10CFUスタン ンを定期的かつ感度良く検査することが ダード（ドイツ・ザルトリウスステディ 重要です。 ムGmbH製）を用いました。このスタン ダードはいずれも凍結乾燥されてお 伝統的な培養法の場合、確実にコンタミ り、1 mLの溶媒に溶解することで容易に ネーションの可能性を排除するためには 10 CFU/mLとすることができます。この 28日以上の培養期間を必要とします。一 スタンダード調製で、マイコプラズマの 方、核酸増殖法（NAT, Nucleic Acid PCRアッセイについて、安全かつ信頼性 Amplification）を用いることでその時間 の高いバリデーションを行うことができ を数時間にまで短縮することができま ます。今回の比較検討には溶媒として5% す。従来の培養法の代替とする場 のFCSを含むDMEMを用いました。 合、NAT試験法が10 CFU/mLのマイコプ ラズマを検出できることを示す必要があ 3種の検出キットについて、いずれも製 ります。 造元のマニュアルにしたがってDNAを抽 そこで、3種のマイコプラズマPCRキッ 出し、続いてPCRを行いました。マイク トについて、ダルベッコ改変イーグル培 ロザルトAMP抽出キットは便利なシリカ 地中（DMEM）の10 CFU/mL以下のマイ カラムをベースとしたプロトコール コプラズマを検出できるかどうかを試験 で、30分以内に操作を完了することがで しました。 きます。競合他社のDNA抽出キットはマ グネチックビーズ上でのDNAを沈殿させ ることを原理としています。3種のうち2 種はTaqManプローブを使用した高感度 システムです。マイクロザルトAMPマイ コプラズマもTaqManプローブを採用し ています。残りの1種はSYBRグリーンを 採用しており、DNA増幅後にマイコプラ ズマのアンプリコンであるか、非特異増 幅産物であるかを区別するために溶解曲 線分析を必要とします。 それぞれのキットにつき、M.arginini, M.oraleおよびS.citriの3種の種に関して DNA抽出からPCR、データ解析まで4回ず つ試験しました。結果を表1に示しまし た。

Sample prep Sample Material Results Standard deviations 結論 and PCR kit of Ct values ザルトリウス製のマイクロザルトAMP 抽出キットおよびマイクロザルトAMP Supplier T 10CFU M. orale Standard 4/4 positive 0.8 0.5 マイコプラズマを競合他社製の2種の Kit for sample (Sartorius Stedim Biotech GmbH) キットと比較検討しました。 preparation 10CFU S. citri Standard 4/4 positive 0.5 計36回DNA抽出およびPCRを行い、す Real-time PCR kit べて陽性のシグナルを得ることができ (Sartorius Stedim Biotech GmbH) ました。このことからすべての製品が 10CFU M. arginini Standard 4/4 positive 0.3 10 CFU/mLのマイコプラズマ汚染を検 (Sartorius Stedim Biotech GmbH) 出できることがわかりました。 Supplier R 10CFU M. orale Standard 4/4 positive 0.7 0.6 結果を詳細にみてみると、マイクロザ Kit for sample (Sartorius Stedim Biotech GmbH) ルトAMP抽出キットとマイクロザルト preparation AMPマイコプラズマキット用いた場合 10CFU S. citri Standard 4/4 positive 0.6 Real-time PCR kit にCt値の標準偏差が一番小さいことか (Sartorius Stedim Biotech GmbH) ら、もっとも変動が少なく再現性が高 10CFU M. arginini Standard 4/4 positive 0.4 いことが分かります。 (Sartorius Stedim Biotech GmbH) PCRキットだけでなく、サンプル調整 方法も再現性に大きく寄与していると Sartorius Stedim 10CFU M. orale Standard 4/4 positive 0.4 0.3 考えられます。シリカ膜を利用した方 Biotech (Sartorius Stedim Biotech GmbH) 法は非常に複雑なサンプル組成から Microsart® AMP DNAを抽出する際でも非常に安定して 10CFU S. citri Standard 4/4 positive 0.3 Extraction いることがよく知られています。一 (Sartorius Stedim Biotech GmbH) Microsart® AMP 方、マグネチックビーズ上でのDNA沈 Mycoplasma 10CFU M. arginini Standard 4/4 positive 0.1 殿法は面倒で安定性が低い傾向にあり ます。 (Sartorius Stedim Biotech GmbH) マイクロザルト・マイコプラズマはす Table 1: PCR results of DMEM+5% FCS with 10 CFU/ml of M. arginini | M. orale | S. citri using kits of べてのPCR試薬を4～８℃に保存する three different suppliers ことができ、製品の高い信頼性に寄与 しています。製品のコールドチェーン に乱れを生じたとしても試薬が融解す るといった問題が生じないため、PCR の検出感度に影響を与えず、偽陰性を 生じることもありません。他のキット は－20℃で凍結保存する必要がある ことから、実際にこれらのキットで試 験をする際には試薬類を解凍する時間 も考慮に入れる必要があります。さら に、一度の試験で試薬類を使いきれな かった場合には再度－20℃で保存す る必要があり、凍結融解を繰り返すこ とで偽陰性を生じる可能性もありま す。 Figure 1: Amplification curves with the kit Microsart® AMP Mycoplasma, using the example of Mycoplasma arginini (10 CFU/ml in DMEM + 5 % FCS), PCR Cycler MxPro 3005P

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