Incucyte(R)試薬、消耗品、ソフトウェア

Incucyte®: 試薬、消耗品、ソフトウェア

Incucyte®試薬、消耗品、ソフトウェア ザルトリウスはアプリケーションのニーズに合わせて特別に リューションでセルヘルス、細胞動態、細胞機能の特異的か デザインされたさまざまな試薬、消耗品、ソフトウェアを提 つ頑健な測定値を得ることで、表現型と機能を病理学的プ 供しており、長期間にわたる生細胞のカイネティックイメー ロセスに結び付けることができます。生物学的に関連する情 ジングと解析を可能にします。最適化されたターンキーソ 報がこれまでになく簡単に得られます。    お使いのアプリケーションのニーズを満たすソリューションを見つけてください： セルヘルス 細胞機能 細胞運動と形態 3Dモデル用アッセイ 主な利点 -- 高感度で非侵襲性の試薬を使用することによって、長期間 組み合わせることにより、豊富な情報を獲得 のライブセル研究において有意義なデータを提供 - Incucyte®消耗品を用いて細胞動態を可視化し、自動化を ラボで検証済みのプロトコルと直感的に使用できるソフト - 複数の試薬を サポート ウェアにより、生産性を向上

Incucyte®試薬一覧表 アプリケーション 試薬 消耗品 ソフトウェア 対応機種 モジュール SX5 S3 神経用S3 SX1 セルヘルス -増殖：- ラベルフリー、コンフルエンス - ラベルフリー、細胞数測定 生 蛍光標識、細胞数測定存率 細胞周期 アポトーシス 細胞毒性 ミトコンドリア膜電位 ATP代謝 ラベルフリー細胞分布解析 細胞機能 細胞傷害性免疫細胞 抗体インターナリゼーション 生細胞を用いた免疫染色 ファゴサイトーシス ネトーシス キナーゼ活性 神経細胞活動 細胞運動と形態 ケモタキシス遊走・浸潤 スクラッチ遊走・浸潤 免疫細胞の活性化・増殖 神経突起伸長 ラベルフリー細胞分布解析 3Dモデル用アッセイ スフェロイド増殖（シングル・マルチスフェロイド） スフェロイド浸潤（シングルスフェロイド） スフェロイドの免疫細胞傷害 オルガノイド培養QC オルガノイドアッセイ ﾠ必要　　 ﾠオプション　　 ﾠ不要　　 ﾠ互換性あり

増殖、細胞数測定、生存率、細胞周期 Incucyte®生細胞標識試薬と専用ソフトウェアにより、長期間 （48時間超）の細胞増殖、生存率および細胞周期解析を - 可能にします。  - - 接着性または非接着性の細胞培養において、ラベルフリー - または標識ありの両方で細胞増殖を動態的に定量。 様々な細胞モデル（単培養、共培養、三培養）で調査 目視で簡単に検証可能な増殖、細胞周期、またはセルヘ 生細胞に影響を及ぼさない試薬を用いて実験アーチファクト ルスのマルチプレックスリードアウトによって各サンプルを を最小限に抑制。保存料無添加、無菌で濃縮されています。 最大限に活用 注目アプリケーション：  Incucyte®生細胞増殖アッセイ ラベルの有無に関わらず増殖を長期間、カイネティック測定 同一細胞集団の経時的な解析を行うことが可能です。 できます。Incucyte® Nuclight試薬はさまざまな種類の Incucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュールは 細胞を均一に標識できるため、細胞に影響を及ぼさずに ラベルフリーで細胞の同定と細胞数計測が可能です。 HT-1080 Nuclight細胞3種共培養 2500 オレンジ色細胞 緑色細胞 合計細胞数 34% 36% 2000 1500 緑色細胞数 1000 オレンジ色細胞数 NIR細胞数 500 NIR細胞 30% 0 Nuclight Green、OrangeまたはNIRを安定して発現するHT-1080線維 0 24 48 72 肉腫細胞を72時間モニタリングした。48時間時点で取得した代表的画像。 時間（時間） ラベルの有無に関わらず、Cell-by-Cell Analysisマスクは自動的に細胞集 団全体を同定し、緑色、オレンジ色、またはNIR発現細胞の割合を定量する。 細胞数

注目アプリケーション：Incucyte®細胞周期アッセイ Incucyte® Cell Cycle Lentivirus試薬を用いて複数の細胞分裂を経た同一細胞集団の細胞周期進行に 対する処理の影響を連続的に定量します。Incucyte®SX5上でIncucyte® Annexin V NIR Dyeを用いて マルチプレックスに解析することでより深い知見が得られます。 有糸分裂期におけるラベルフリー細胞の分類 細胞周期の蛍光分類 20 80 15 60 10 40 5 20 0 0 24 36 48 60 24 36 48 60 時間（時間） 時間（時間） 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 ソフトウェア Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュールを用いて、ラベルフリーの細胞数計測を実施し、次に形状、大きさまたは蛍光 強度に基づいて細胞ごとに分類し、不均一な培養細胞集団から細胞サブセットの動的変化を定量します。細胞数を計測し、ラベル フリーの画像分割と細胞形状の多変量解析から接着細胞の形態変化を追跡します。分類アルゴリズムのための学習はコントロール ウェルを使用して行います。Advanced Label-Free Classicationソフトウェアモジュールの追加にはIncucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュール（カタログ番号：9600-0031）が必要です。 Incucyte® Cell-by-Cell Analysis 1モジュール 9600-0031 SX5、S3、神経科学研究用S3、SX1 ソフトウェアモジュール Incucyte® Advanced Label-Free 1モジュール BA-04867 SX5、S3、神経科学研究用S3、SX1 Classification Analysisソフトウェアモジュール 核染色標識試薬 細胞核を特異的に標識する細胞膜透過性のDNA染色色素です。培地に添加するだけの簡便な仕様で、細胞増殖と生存率を 検証するために最適です。 Incucyte® Nuclight Rapid Red Dye 1バイアル： 50 µL 4717 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Rapid NIR Dye 1バイアル：50 µL 4804 SX5、神経科学研究用S3 *レンチウイルス レンチウイルス試薬により核に限定された蛍光タンパク質が均一に発現し、細胞機能を変えることなく生細胞の細胞増殖と生存 核標識試薬 率を定量できます。 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus (puro) 0.2 mL 4624 SX5、S3、SX1 0.6 mL 4475 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus (puro) 0.2 mL 4625 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 0.6 mL 4476 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus (bleo) 0.2 mL 4626 SX5、S3、SX1 0.6 mL 4477 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus (bleo) 0.2 mL 4627 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 0.6 mL 4478 Incucyte® Nuclight Orange Lentivirus (puro) 0.2 mL 4771 SX5、神経科学研究用S3 Incucyte® Nuclight NIR Lentivirus (puro) 0.2 mL 4805 SX5、神経科学研究用S3 細胞周期 蛍光ユビキチンベースの細胞周期指示薬（FUCCI）です。組み合わせた蛍光タンパク質が均一に発現し、間期と有糸分裂期の レンチウイルス試薬 細胞が区別できます。 Incucyte® Cell Cycle Green/Red Lentivirus 0.2 mL 4779 SX5（Green/Red Optical (puro) モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Cell Cycle Green/Orange 0.2 mL 4809 SX5 Lentivirus (puro) * 蛍光標識済みのNuclight細胞株もご購入いただけます。詳細情報はwww.sartorius.com/shopをご覧ください。 有糸分裂（%） 細胞周期集団（%）

アポトーシス、細胞毒性、ミトコンドリア膜電位、 ATP代謝 セルヘルスに影響を及ぼさないIncucyte®試薬は数日間に 及ぶカイネティック測定が可能で、投薬に対する時間依存的 - mix-and-readまたは新しい遺伝子コード型試薬と最適化 - プロトコールを用いて、貴重な細胞の喪失や細胞傷害を応答と細胞特異的応答を評価できます。 削減  - 単一ウェル内でセルヘルス試薬を組み合わせて複数のパラ 細胞に影響を及ぼさない生細胞試薬を用いてセルヘルス メーター解析を実施し、情報の豊富なデータを生成 を維持し、アーチファクトのない真の生物学的応答を追跡 - あらゆる時点での高精細度（HD）位相画像から細胞形態 の変化を確認し、結果を検証 注目アプリケーション：  Incucyte®アポトーシスアッセイ アポトーシス経路解析用にデザインされた2種類の試薬を用い Annexin V Dyeを用いて細胞外膜に露出したフォスファチジル て細胞死を評価します。Incucyte® Caspase-3/7 Dyeを用い セリンを標識、同定します。細胞死の核数をマルチプレックス てカスパーゼ3/7活性を直接検出できます。また、Incucyte® に測定することにより、洞察を深めることができます。 コントロール 1 µMカンプトセシン 600 コントロール 80 0.11 µM 500 0.33 µM 60 1 µM 400 0.001 µM 0.004 µM 300 40 0.04 µM 0.01 µM 200 0.04 µM 20 0.01 µM 100 0.11 µM 0.33 µM 0.004 µM 1 µM 0.001 µM 0 0 コントロール 0 12 24 36 48 0 12 24 36 48 時間（時間） 時間（時間） Nuclight NIRを安定して発現するHT-1080線維肉腫細胞（青疑似色）に対して、Incucyte® Caspase-3/7 Green Dye（緑疑似色）存在下で複数濃度 のカンプトセシンを処理した。一連の画像より細胞生存率とアポトーシス性細胞死両方のカイネティックデータを検証。 NIR核数 カスパーゼ陽性緑色細胞（%）

注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 ソフトウェア Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュールを用いて、ラベルフリーの細胞数計測を実施し、次に形状、大きさまたは蛍光 強度に基づいて細胞ごとに分類し、不均一な培養細胞集団から細胞サブセットの動的変化を定量します。細胞数を計測し、ラベル フリーの画像分割と細胞形状の多変量解析から接着細胞の形態変化を追跡します。分類アルゴリズムのための学習はコントロール ウェルを使用して行います。Advanced Label-Free Classicationソフトウェアモジュールの追加にはIncucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュール（カタログ番号：9600-0031）が必要です。 Incucyte® Cell-by-Cell Analysis 1モジュール 9600-0031 SX5、S3、神経科学研究用S3、 ソフトウェアモジュール SX1 Incucyte® Advanced Label-Free 1モジュール BA-04867 SX5、S3、神経科学研究用S3、 Classification Analysisソフトウェアモジュール SX1 カスパーゼ活性試薬 細胞膜を自由に透過する不活性非蛍光（DEVD）物質です。活性化カスパーゼ3/7によって切断され、DNA結合蛍光標識を 放出します。 Incucyte® Caspase-3/7 Green Dye 1バイアル：20 µL 4440 SX5、S3、SX1 （100～ 200回分） Incucyte® Caspase-3/7 Red Dye 1バイアル：20 µL 4704 SX5（Green/Red Optical （100～ 200回分） モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Caspase-3/7 Dye for 1バイアル：20 µL 4776 SX5（SX5 Metabolism Optical Metabolism 100～ 200回分） モジュール用の設定） アポトーシス 膜非透過性で高選択性のフォスファチジルセリン（PS）に結合するシアニン蛍光色素です。アポトーシス中の細胞の細胞外表面 細胞膜完全性試薬 上に露出したPSを標識します。 Incucyte® Annexin V Green Dye 1バイアル： 4642 SX5、S3、SX1 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V Red Dye 1バイアル： 4641 SX5（Green/Red Optical 100～ 200回分 モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Annexin V Orange Dye 1バイアル： 4759 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V NIR Dye 1バイアル： 4768 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 細胞毒性試薬 生細胞には非透過性の高感度シアニンベースの色素です。傷害を受けている細胞膜を透過し、DNAに結合することによって 蛍光を発します。色素は健全な細胞膜では透過しません。 Incucyte® Cytotox Green Dye 5バイアル：5 µL 4633 SX5、S3、SX1 （各100回分） Incucyte® Cytotox Red Dye 5バイアル：5 µL 4632 SX5（Green/Red Optical （各100回分） モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Cytotox NIR Dye 1バイアル：100 µL 4846 SX5、神経科学研究用S3 （500～ 200回分） 新製品！ 膜間腔に拡散し、MMPに比例して蓄積する蛍光色素です。蛍光強度の変化はミトコンドリア膜電位の状況を表します。解析に ミトコンドリア膜電位 はIncucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュールが必要です。 （MMP） 新製品！Incucyte® MMP Orange Reagent 1キット 4775 SX5、神経科学研究用S3 K- it: MMP Orange Dye 1バイアル：30 µL （200回分） - - FCCP 1バイアル：10 µL （16回分） Oligomycin A 1バイアル：10 µL （16回分） 新製品！ ATPを直接カイネティック測定し、高度な細胞モデルのがん細胞代謝の変化を解析します。 ATP代謝 ソフトウェア 蛍光画像を捕捉することでATP動態を解析でき、96または384ウェルプレートの各ウェル中で細胞形態の関連変化を定量的に モニタリングできます。 新製品！Incucyte® ATP Analysisソフトウェア 1モジュール 9600-0033 SX5（SX5 Metabolism Optical モジュール モジュール用の設定） 代謝試薬 生細胞の細胞質ATPを直接測定するための遺伝子コード型蛍光ATP指示薬です。 新製品！ Incucyte® CytoATP Lentivirus 1バイアル：0.2 mL 4772 SX5（SX5 Metabolism Optical (puro) モジュール用の設定）

免疫細胞の活性化、細胞傷害、 ネトーシス Incucyte®免疫細胞アッセイはT細胞の活性化や細胞傷害 細胞に影響を及ぼさない高感度試薬とHD位相画像により 性、そして好中球のプログラム細胞死といった幅広い免疫 - 有意義なデータを抽出 細胞機能をリアルタイムで可視化し、自動解析するための 統合型ソリューションです。  -- 2Dまたは3Dのin vitroアッセイモジュールで細胞死、生存 率、増殖をマルチプレックスに測定 複雑な共培養中での細胞の相互作用を動的かつ経時的に 可視化および定量化 注目アプリケーション：  標的細胞死（Annexin V NIR） Incucyte®免疫細胞による 2.5 活性化 細胞傷害アッセイ 2.0 1.5 免疫細胞の腫瘍細胞傷害作用について経時的な変化と細胞間 1.0 の相互作用を捕捉、視覚化し、自動的に定量します。 非活性化 0.5 Incucyte®セルヘルス試薬と増殖評価用試薬を用いて、腫瘍 細胞死、腫瘍細胞の増殖 0 PBMCコントロールなし /生存率、免疫細胞の健康状態を 0 12 24 36 48 60 マルチプレックスに測定できます。 時間（時間） 標的細胞増殖/生存率（Nuclight Orange） 400 300 PBMCコントロールなし 200 100 非活性化 活性化 0 0 12 24 36 48 60 時間（時間） エフェクター細胞増殖（Cytolight Rapid Green） 300 活性化PBMC 200 Incucyte® Annexin VNIRの存在下でIncucyte® Nuclight Orangeを導 入したMDA-MB-231腺がん細胞とIncucyte® Cytolight Rapid Greenで 100 標識した活性化PBMCまたは非活性化PBMCを共培養した。NIR（青疑 非活性化PBMC 似色）蛍光面積は細胞死、オレンジ色（疑似赤色）蛍光オブジェクト数は 標的細胞の増殖/生存率の定量を示す。エフェクター細胞（緑疑似色）の 0 増殖は、実験期間中の緑色オブジェクト数に基づいて定量した。 0 12 24 36 48 60 時間（時間） 緑色オブジェクト数/ウェル オレンジ色オブジェクト数/ウェル NIR総面積（x 104）

注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 ソフトウェア Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュールを用いて、ラベルフリーの細胞数計測を実施し、次に形状、大きさまたは蛍光強度 に基づいて細胞ごとに分類し、不均一な培養細胞集団から細胞サブセットの動的変化を定量します。細胞数を計測し、ラベルフリー の画像分割と細胞形状の多変量解析から接着細胞の形態変化を追跡します。分類アルゴリズムのための学習はコントロールウェル を使用して行います。Advanced Label-Free Classicationソフトウェアモジュールの追加にはIncucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェアモジュール（カタログ番号：9600-0031）が必要です。 Incucyte® Cell-by-Cell Analysisソフトウェア 1モジュール 9600-0031 SX5、S3、神経科学研究用S3、 モジュール SX1 Incucyte® Advanced Label-Free 1モジュール BA-04867 SX5、S3、神経科学研究用S3、 Classification Analysisソフトウェアモジュール SX1 *レンチウイルス レンチウイルス試薬により核に限定された蛍光タンパク質が均一に発現し、細胞機能を変えることなく生細胞の細胞増殖と生存率 核標識試薬 が定量できます。 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus 0.2 mL 4624 SX5、S3、SX1 (puro) 0.6 mL 4475 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus (puro) 0.2 mL 4625 SX5（Green/Red Optical 0.6 mL 4476 モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus (bleo) 0.2 mL 4626 SX5、S3、SX1 0.6 mL 4477 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus (bleo) 0.2 mL 4627 SX5（Green/Red Optical 0.6 mL 4478 モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Orange Lentivirus 0.2 mL 4771 SX5、神経科学研究用S3 (puro) Incucyte® Nuclight NIR Lentivirus (puro) 0.2 mL 4805 SX5、神経科学研究用S3 細胞質標識色素試薬 生細胞の細胞質標識色素は細胞膜を自由に細胞内に透過し、細胞内で細胞膜非透過性の形状に変換されるため、細胞間の相互 作用に対する空間的状況が把握できます。標的細胞またはエフェクター細胞のいずれかに標識を使用します。 Incucyte® Cytolight Rapid Green Dye 1バイアル： 15 μg 4705 SX5、S3、SX1 Incucyte® Cytolight Rapid Red Dye 5バイアル：50 μg 4706 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Cytolight Rapid Orange Dye 1バイアル： 1 mg 4839 SX5、神経科学研究用S3 カスパーゼ活性試薬 細胞膜を自由に横断する不活性非蛍光（DEVD）物質です。活性化カスパーゼ3/7によって切断され、DNA結合蛍光標識を放出 します。接着標的細胞におけるアポトーシスの定量に推奨されます。 Incucyte® Caspase-3/7 Green Dye 1バイアル：20 µL 4440 SX5、S3、SX1 （100～ 200回分） Incucyte® Caspase-3/7 Red Dye 1バイアル：20 µL 4704 SX5（Green/Red Optical （100～ 200回分） モジュール用の設定）、S3、SX1 アポトーシス 膜非透過性のフォスファチジルセリン（PS）高選択性シアニン蛍光色素が、アポトーシス中の細胞の細胞外表面上に露出したPS 細胞膜完全性試薬 を標識します。非接着標的細胞におけるアポトーシスの定量に推奨されます。 Incucyte® Annexin V Green Dye 1バイアル： 4642 SX5、S3、SX1 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V Red Dye 1バイアル： 4641 SX5（Green/Red Optical 100～ 200回分 モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Annexin V Orange Dye 1バイアル： 4759 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V NIR Dye 1バイアル： 4768 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 細胞毒性試薬 高感度シアニンベースの色素は細胞膜が傷害されているときに細胞膜を透過し、DNAに結合すると蛍光を発します。色素は健全 な細胞膜の細胞には透過しません。ネトーシスでは細胞外にDNAが放出され、蛍光増強が起こるため、迅速な視覚化と定量が 可能です。 Incucyte® Cytotox Green Dye 5バイアル：5 µL 4633 SX5、S3、SX1 （各100回分） Incucyte® Cytotox Red Dye 5バイアル：5 µL 4632 SX5（Green/Red Optical （各100回分） モジュール用の設定）、S3、SX1 Incucyte® Cytotox NIR Dye 1バイアル：100 µL 4846 SX5、神経科学研究用S3 （500～ 100回分） * 蛍光標識済みのNuclight細胞株もご購入いただけます。 詳細情報はwww.sartorius.com/shopをご覧ください。

抗体インターナリゼーションと 免疫細胞化学 Incucyte®抗体標識試薬は新しい蛍光標識されたFabです。 Fc含有抗体と混合することができ、生細胞に直接使用して、 - 抗体パネルの効率的な試験のためにmix-and-readプロト - コールと組み合わせた迅速なシングルステップ標識によりタンパク質の空間的・時間的動態を長期間モニタリングし 生産性を向上 ます。 - 表面タンパク質発現または抗体インターナリゼーションの 変化を経時的な細胞機能と形態に関連付け タンパク質動態の高感度かつ蛍光カイネティック測定と 画像・動画を組み合わせ、すべてのウェルの生態を目視で 確認 注目アプリケーション：  動的な細胞表面タンパク質発現のモニタリング Incucyte® Fabfluor-488またはFabfluor-594 Antibody Labeling試薬を用いて、生細胞の 細胞表面タンパク質発現と分布を定量化し、長期間のタンパク質動態および機能と形態との 関連を検証します。 0日目 1日目 2日目 6 6 50 ng/mL 25 ng/mL 4 12.5 ng/mL 4 6.3 ng/mL 3.1 ng/mL Incucyte® Fabfluor-488を抗PD-L1抗体 （BioLegend）に結合させ、IFNγ（+ Incucyte® 2 1.6 ng/mL 2 IFNγなし Opti-Greenバックグラウンド抑制剤）の存在下 または非存在下でNuclight Red MDA-MB-231 乳がん細胞に添加。緑色蛍光面積の定量はIFNγ によるPD-L1発現の時間依存的・濃度依存的 0 0 増加誘導を示す。 0 24 48 72 1 10 100 時間（時間） log [IFNγ]（ng/mL） 緑色面積（µm2/ウェル） 緑色面積（µm2/ウェル）

注目アプリケーション：  抗体 インターナリゼーション Incucyte® Fabfluor-pH抗体標識試薬を用いて 抗体インターナリゼーションにおけるすべての経 Herceptin―Fabfluor-pH Orange IgG―Fabfluor-pH Orange 時的変化を効率的に評価し、生理学的条件下で Orange Object Area (µm2/well) Herceptin-FabFluor のインターナリゼーション率のリアルタイム解析 4 x 1034 を行います。 660 x 1055 3 x 103 HD位相画像とオレンジ色蛍光画像（10x）。 3 Incucyte® Fabfluor-pH Orange標識ハーセプチンで 処理したHER-2陽性BT-474細胞はオレンジ色（赤疑 40 x 10450 Herceptin-Fabfluor 似色）の細胞質蛍光を示すが、アイソタイプコントロール 2 x 1032 で処理した細胞は細胞内蛍光を示さない。経時的データ は標識されたハーセプチンで処理した細胞の経時的なオ レンジ色オブジェクト面積の急激な増加を示すが、IgG1 20 x 10250 1 x 1031 アイソタイプコントロールでは面積増加を示さない。 IgG-Fabfluor 培地 IgG-FabFluor 0 00 0 media 0 12 24 36 48 --88 --7 --6 --5 時T間im（e時 (h間)） log [HLoeg r[Hceercpepttiinn]] (（g/mgL/)mL） 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 ソフトウェア ラベルフリーの細胞数計測を実施し、次に形状、大きさまたは蛍光強度に基づいて細胞ごとに分類し、不均一な生細胞培養中 の細胞サブセットの動的な変化を定量します。 Incucyte® Cell-by-Cell Analysis 1モジュール 9600-0031 SX5、S3、神経科学研究用S3、SX1 ソフトウェアモジュール Fabfluor-pH 新しいpH感受性Fc標的抗体フラグメントです。抗体インターナリゼーションのリアルタイム解析のために選択した抗体を蛍光標 抗体標識試薬 識します。 Incucyte® Human Fabfluor-pH Orange 1バイアル： 50 µg 4812 SX5、神経科学研究用S3 Antibody Labeling Dye Incucyte® Human Fabfluor-pH Red 1バイアル：50 µg 4722 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Antibody Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Incucyte® Mouse IgG1 Fabfluor-pH Red 1バイアル：50 µg 4723 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Antibody Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Incucyte® Mouse IgG2a Fabfluor-pH Red 1バイアル：50 µg 4750 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Antibody Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Incucyte® Mouse IgG2b Fabfluor-pH 1バイアル：50 µg 4751 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Red Antibody Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Incucyte® Rat Fabfluor-pH Red Antibody 1バイアル：50 µg 4737 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Fabfluor生細胞免疫 新しい蛍光タグ付きFc標的Fabフラグメントを用いて、細胞表面に発現するタンパク質を検出するために選択した抗体を標識し 細胞化学標識試薬 ます。 Incucyte® Mouse IgG2a Fabfluor-488 1バイアル：50 µg 4743 SX5、S3、SX1 Antibody Labeling Dye Incucyte® Mouse IgG2b Fabfluor-488 1バイアル：50 µg 4744 SX5、S3、SX1 Antibody Labeling Dye Incucyte® Mouse IgG1 Fabfluor-488 1バイアル：50 µg 4745 SX5、S3、SX1 Antibody Labeling Dye Incucyte® Mouse IgG1 Fabfluor-594 1バイアル：50 µg 4844 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Antibody Labeling Dye の設定）、S3、SX1 Incucyte® IgG2a Fabfluor-594 Antibody 1バイアル：50 µg BA-04863 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 Labeling Dye の設定）、S3、SX1 オレンジ色オブジェクト（µm2/ウェル） AUC（0～ 48時間）

スフェロイド増殖・浸潤、 細胞傷害性免疫細胞 Incucyte®スフェロイド解析ソフトウェアモジュールはラベル ありまたはラベルフリーのスフェロイドを取得・解析するよう - デザインされており、組織培養インキュベーター内の高度な 細胞モデルに関する形成、増殖、収縮、浸潤特性をリアル - 柔軟な取得モードによりシングルスフェロイドとマルチス フェロイドのいずれのアッセイも試験可能 フォーカスした明視野（DF®明視野）画像取得の深度を 増やして長期間のイメージングが可能 タイムかつ自動的にモニタリング・定量します。 - 直感的なIncucyte®プロセス定義を用いて関連するスフェ ロイドメトリクスを解析 注目アプリケーション：  3D細胞傷害性免疫細胞 細胞に影響を及ぼさない試薬と専用の統合型Incucyte® Spheroid Analysis ソフトウェアモジュールを用いて、固形腫瘍の免疫細胞介在性傷害を リアルタイムで定量し、視覚化します。 SKOV3-NR BT-474-CyG MCF7-NR + ハーセプチン（1 µg mL） + ハーセプチン（1 µg mL）+ PBMC Incucyte® Nuclight Red Lentivirus（SKOV3-NR、MCF7-NR）またはIncucyte® Cytolight Green Lentivirus（BT-474-CyG）のいずれかを安定 発現する腫瘍細胞を平底96ウェルプレート中のMatrigel® ベッド上に播種。新鮮分離したPBMC（E:T=5:1）とハーセプチンの添加前にマルチスフェロイド を形成させた（3 d）。Incucyte® BFと蛍光画像（7 d：SKOV3-NR、MCF7-NRまたは10 d：BT-474-CyG）について、PBMCの非存在下（上図） または存在下（下図）でスフェロイド増殖に関するハーセプチンの影響を比較した（BF輪郭マスクは黄色で表示）。

注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 スフェロイド 丸底マルチウェルフォーマット内のシングルスフェロイドの増殖、生存率、浸潤を解析したり、増殖と生存率の変化を検出するた ソフトウェア めに平底プレート内のマルチスフェロイドを測定したりすることができます。 Incucyte® Spheroid Analysis 1モジュール 9600-0019 SX5、S3、神経科学研究用S3、SX1 ソフトウェアモジュール *レンチウイルス レンチウイルス試薬により核に限定された蛍光タンパク質が均一に発現し、細胞機能を変えることなく生細胞の細胞増殖と生存 核標識試薬 率が定量できます。 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus 0.2 mL 4624 SX5、S3、SX1 (puro) 0.6 mL 4475 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus 0.2 mL 4625 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 (puro) の設定）、S3、SX1 0.6 mL 4476 Incucyte® Nuclight Green Lentivirus 0.2 mL 4626 SX5、S3、SX1 (bleo) 0.6 mL 4477 SX5、S3、SX1 Incucyte® Nuclight Red Lentivirus 0.2 mL 4627 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 (bleo) の設定）、S3、SX1 0.6 mL 4478 Incucyte® Nuclight Orange Lentivirus 0.2 mL 4771 SX5、神経科学研究用S3 (puro) Incucyte® Nuclight NIR Lentivirus 0.2 mL 4805 SX5、神経科学研究用S3 Reagent (puro) アポトーシス細胞膜完 膜非透過性高選択性フォスファチジルセリン（PS）シアニン蛍光色素が、アポトーシス中の細胞の細胞外表面上に露出したPS 全性試薬 を標識します。 Incucyte® Annexin V Green Dye 1バイアル： 4642 SX5、S3、SX1 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V Red Dye 1バイアル： 4641 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 100～ 200回分 の設定）、S3、SX1 Incucyte® Annexin V Orange Dye 1バイアル： 4759 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 Incucyte® Annexin V NIR Dye 1バイアル： 4768 SX5、神経科学研究用S3 100～ 200回分 細胞質標識色素試薬 生細胞の細胞質標識色素は細胞膜を自由に細胞内に透過し、細胞内で細胞膜非透過性の形状に変換されるため、細胞間の 相互作用に対する空間的状況が把握できます。 Incucyte® Cytolight Rapid Green Dye 1バイアル：15 μg 4705 SX5、S3、SX1 Incucyte® Cytolight Rapid Red Dye 5バイアル：50 μg 4706 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 の設定）、S3、SX1 レンチウイルス レンチウイルス試薬により蛍光タンパク質が均一に発現し、細胞機能を変えることなく生細胞のスフェロイドの増殖と収縮を定量 細胞質標識試薬 します。 Incucyte® Cytolight Green Lentivirus 0.6 mL 4481 SX5、S3、SX1 (puro) Incucyte® Cytolight Red Lentivirus 0.6 mL 4482 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 (puro) の設定）、S3、SX1 * 蛍光標識済みのNuclight細胞株もご購入いただけます。 詳細情報はwww.sartorius.com/shopをご覧ください。

オルガノイド培養QC、 オルガノイドアッセイ Incucyte®オルガノイド解析ソフトウェアモジュールでは、 ラベルフリーで画像の取得により、オルガノイドの生成から、 -- Matrigel®に包埋されたオルガノイドを自動的に探し出し、 解析 維持（オルガノイド培養QC）、オルガノイドの増殖に対する 生体により近い条件下で、経時的なラベルフリー解析を 投薬効果の評価（オルガノイドアッセイ）を測定から解析と 実施 いったオルガノイドワークフロー全体の標準化が可能です。 - 定量データを使用し、継代決定のサポートと記録を行い、 大きさ、数、形態についてバイアスのない評価を通して 投薬の影響を検証 注目アプリケーション：  オルガノイド培養QC 継続的な画像解析によりさまざまな種類の種類のオルガノイドを評価。 24または48ウェルプレートに作成したMatrigel®ドーム中のオルガノイ ドの分化と成熟を特性評価します。 腸管オルガノイド 膵臓オルガノイド 肝臓オルガノイド ドーム全体 拡大 + BF マスクした 輪郭 100 100 100 75 腸管 75 膵臓 75 オルガノイド オルガノイド 肝臓 50 50 50 オルガノイド 25 25 25 0 0 0 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 0 24 48 72 96 120 時間（時間） 時間（時間） 時間（時間） マウスの腸管オルガノイド、膵臓オルガノイド、肝臓オルガノイドは24ウェルプレートでMatrigel®（50%または100%）ドームに包埋し、 Incucyte®で撮像した。Incucyte®オルガノイド解析ソフトウェアモジュールを使用して6～ 8日間にわたりそれぞれのオルガノイドを自動的 に探し出し撮像した。経時的プロファイルと明視野画像より、細胞型特異的な分化、形態、増殖が示される。 オルガノイドオブジェクト 合計BF面積 x 104（µm2） オルガノイドオブジェクト 合計BF面積 x 104（µm2） オルガノイドオブジェクト 合計BF面積 x 104（µm2）

注目アプリケーション：オルガノイドアッセイ Incucyte®オルガノイド解析ソフトウェアモジュールを用いて、Matrigel®に包埋されたオルガノイドを 自動的に追跡します。オルガノイド解析の標準化および、オルガノイドを生体により近づけた環境下で リアルタイムで実施し、治療転帰をより正確に予測します。 A. コントロール（DMSO、0.1%） スタウロスポリン（1 µM） 12 コントロール 9 （DMSO、0.1%） 腸管 6 オルガノイド スタウロスポリン t = 処理後 3 （1 µM） 10日目 0 0 48 96 144 192 240 時間（時間） 20 コントロール （DMSO、0.1%） 15 肝臓 10 オルガノイド スタウロスポリン t = 処理後 5 （1 µM） 2日目 0 0 24 48 72 96 時間（時間） B. 肝臓 数 偏心度 暗さ 拡大 BF画像 オルガノイド 80 コントロール 0.65 80 スタウロスポリン スタウロスポリン （DMSO、0.1%） 70 0.60 （1 µM） 75 （1 µM） コントロール 0.55 70 60 0.50 コントロール （DMSO、0.1%） 65 50 スタウロスポリン 0.45 60 コントロール（DMSO、0.1%） 40 （1 µM） 0.40 55 0 スタウロスポリン 24 48 72 96 0 24 48 72 96 0 24 48 72 96 時間（時間） 時間（時間） 時間（時間） 明視野（A）の画像は、96ウェルプレートでMatrigel® (50%）に包埋し、媒体またはスタウロスポリン（SSP）による処理前の3日間にわたり オルガノイド形成させたマウスの腸管オルガノイドと肝臓オルガノイド（1k細胞/ウェル）。対応する占有面積の経時的変化は、溶媒で処理したオルガ ノイドの増殖の継続と、両細胞型にわたるSSPの阻害作用を示している。SSPで処理したオルガノイドは、経時的に特徴的な丸みを帯びた細胞型（偏 心度の増加）が失われ、暗度が増加している（B）。 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 オルガノイド 24または48ウェルプレート中の培養オルガノイドの分化と成熟の特性を評価し、96ウェルマイクロプレート中のオルガノイド増殖 ソフトウェア に対する投薬効果を評価します。 Incucyte® Organoid Analysis 1モジュール 9600-0034 SX5、S3、SX1 ソフトウェアモジュール BF数（1/画像） 平均偏心度 オルガノイドの暗さ 合計占有面積 合計占有面積 x 104µm2 x 104µm2

エフェロサイトーシス pHrodo® Cell Labeling Kit for Incucyte®は経時的な死細胞、 アポトーシス性細胞または抗体標的細胞の貪食について -- 96/384ウェル対応したmix-and-readプロトコールと組み 合わせ、選択したモデルの貪食を経時的に検証 長期解析用に調整されています。 - 抗体（例、抗CD-47）を添加することにより抗体依存性 細胞貪食（ADCP）を定量 HD位相差画像と蛍光画像を用いてファゴサイトーシス シグナルを確認 注目アプリケーション：  エフェロサイトーシスアッセイ pHrodo® Orange Cell Labeling Dye for Incucyte®に サイトカラシンD IC50 より標識した標的細胞を用いて、アッセイの期間、継続的 20 にエフェロサイトーシスを観察し、測定します。 15 10 5 N2A 0 -8 -7 -5 -6 log（M） サイトカラシンDによる エフェロサイトーシスの阻害 ミクログリア 20 コントロール pHrodo® Orange標識したNeuro-2A（N2A）アポトーシス性細胞を 15 取り込んでいるiPSC由来ミクログリア（Axol BioScience）のタイム 0.1 µM ラプス画像。画像からアポトーシス性標的細胞がミクログリアの細胞質に 10 取り込まれていることが確認できる。この取り込みをサイトカラシンDで 0.3 µM 阻害し、実験期間を通じてオレンジ色蛍光オブジェクト面積に基づいて 5 1 µM 定量した。 3 µM 0 10 µM 0 4 8 12 16 20 24 時間（時間） 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 pHrodo® Cell pH感受性蛍光色素が細胞全体を標識するため、エフェロサイトーシスと抗体依存性細胞貪食をリアルタイムに解析できます。 Labelingキット pHrodo® Orange Cell Labeling Kit 1キット 4766 SX5 for Incucyte® pHrodo® Red Cell Labeling Kit 1キット 4649 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 for Incucyte® の設定）、S3、SX1 蛍光オブジェクト合計面積 蛍光オブジェクト合計面積 （x 104 mm²/画像） （x 104 mm²/画像）

ファゴサイトーシス pHrodo® Bioparticles® for Incucyte®はpH感受性結合 96および384ウェルのシンプルなmix-and-readプロト プローブです。免疫細胞によるグラム陽性細菌、グラム陰性 - ールにより、リアルタイムでファゴサイトーシスをモニタ 細菌、酵母由来の生体粒子のインターナリゼーション解析用 に特別に調製されています。 - コ- リング タイムラプス画像と動画を用いてファゴサイトーシスを検証 実験期間全体の貪食能に対する各種処理の効果を検証 注目アプリケーション：  Bioparticles®のファゴサイトーシス 1.2 x 105 30 µM 10 µM 8 x 104 3.33 µM 0時間 4時間 12時間 1.11 µM .37 µM 4 x 104 0 0.12 µM 0.04 µM 0 媒体 0 4 8 12 16 20 24 Bioparticles 時間（時間） 1.2 x 105 サイトカラシンD 0時間 4時間 12時間 ラントルキュリンA 8 x 104 LY294002 4 x 104 0 -8 -6 -4 log [Drug（] M） 阻害剤存在下でのJ774A.1マウスマクロファージによるpHrodo® Green E.coli Bioparticles® for Incucyte®のファゴサイトーシス。サイトカラシンD によるBioparticle®ファゴサイトーシスの阻害をコントロールと比較した12時間のタイムラプス画像。経時的変化ではサイトカラシンDによる阻害も示され ている。サイトカラシンD、ラントルキュリンA、LY294002によるファゴサイトーシス阻害を比較した24時間時点での濃度反応曲線。 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 pHrodo® 無菌蛍光試薬は、ファゴサイトーシスのシンプルかつmix-and-readの簡単な操作で、生細胞を使用したリアルタイム定量に最適です。 Bioparticles® pHrodo® Red E. coli Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：2 mg 4615 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 pHrodo® Green E. coli Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：2 mg 4616 SX5、S3、SX1 pHrodo® Red Zymosan Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：1 mg 4617 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 pHrodo® Green Zymosan Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：1 mg 4618 SX5、S3、SX1 pHrodo® Red S. aureus Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：2 mg 4619 SX5（Green/Red Optical モジュール用の設定）、S3、SX1 pHrodo® Green S. aureus Bioparticles® for Incucyte® 1バイアル：2 mg 4620 SX5、S3、SX1 30 µMサイトカラシンD 媒体 緑色面積（µm2/画像、24時間） 緑色オブジェクト面積（µm2/画像） サイトカラシンD

神経突起動態、ニューロン活動 新しいIncucyte®生細胞標識試薬と専用のソフトウェアは に影響を及ぼさない蛍光試薬を用いてニューロン機能 神経突起動態と神経細胞活動の長期間変化を定量し、 - に関する長期間試験を実行 高感度な神経細胞モデルの連続的解析が可能です。 - 細胞 生体に近づけた環境下で同一ニューロン培養系を非侵襲 - 的に繰り返し測定。選択した細胞モデル全イベントを見逃しません。 直感的に使用できる専用のIncucyte®ソフトウェアにより、 形態学的、機能的変化を解析 注目アプリケーション：  Incucyte® rCortical Neurons ニューロン活動アッセイ 新しいIncucyte® Neuroburst Orange Lentivirus と Incucyte® Neuronal Activity Analysisソフトウェアモジュール iCell GlutaNeurons を使用して、何千もの細胞から複雑な神経細胞活動と細胞間 の接合性を長期的に評価することにより、ニューロンモデルの 機能への理解を今まで以上に深めることができます。 Incucyte® rCortical NeuronsとiCell GlutaNeurons（Cellular Dynamics International）はセルヘルスと細胞の形態に影響を 及ぼすことなく橙色蛍光たんぱく質を発現。 7日目 12日目 強度（OCU） 活性オブジェクト数= 1363 強度（OCU） 活性オブジェクト数= 2003 平均バースト 4.8 平均相関 = 0.493 4.8 平均相関 = 0.864 平均相関 率/分 4.2 4.2 1.00 9 3.6 3.6 相関 3.0 3.0 0.75 6 2.4 2.4 0.50 1.8 1.8 1.2 1.2 3 0.25 バースト率 0.6 0.6 0 0 0.00 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 5 10 15 20 時間（秒） 時間（秒） 時間（日） 4日目 19日目 強度（OCU） 活性オブジェクト数= 118 強度（OCU） 活性オブジェクト数= 2028 4.8 平均相関 = 0.0161 4.8 平均相関 = 0.828 4.2 4.2 Neuroburst Orangeを発現するiCellGluta 3.6 3.6 Neuronsのニューロン活動（平均バースト率 3.0 3.0 と平均相関）における長期的な動的変化の カイネティック定量（グラフ上部）。ニューロン 2.4 2.4 ネットワーク成熟中の経時的変化を表す。 1.8 1.8 活性オブジェクトトレースより、取得したすべ 1.2 1.2 ての時点におけるニューロン活動と接続性の 0.6 0.6 動的変化に関する詳細な情報が得られる。 0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 時間（秒） 時間（秒）

注目アプリケーション：神経突起動態アッセイ 神経突起伸長と安定性に関する継続的な解析のために、 神経突起長のグルタミン酸への反応 Incucyte® Neurotrack Analysisソフトウェアモジュール 250 を用いてインキュベーター内で画像ベースの自動化され コントロール たカイネティック測定を実施します。 200 0.3 µM 3 µM 150 30 µM 100 300 µM IIncucyte® Neurolight Orange Lentivirusを形質導入したIncucyte® 50 rCortical NeuronsをIncucyte® rAstrocytesと共培養し、10日目にグル タミン酸で処理した。オレンジ色蛍光を持つ神経突起長の経時的解析より、 濃度依存的な処理効果が示された。 0 0 2 4 6 8 10 12 14 時間（日） 2日目 6日目 10日目 注文情報 製品 説明 カタログ番号 互換性のある装置 ニューロン活動 1000個以上の細胞の活動を記録し、ニューロンネットワーク活動と接続性の変化を検証します。 ソフトウェア 専用の画像取得および解析ソフトウェアにより、96ウェルプレートを用いて、カルシウムオシレーションを検出します。 Incucyte® Neuronal Activity Analysis 1モジュール 9600-0032 SX5、神経科学研究用S3 ソフトウェアモジュール ニューロン活動試薬 新しい遺伝子コード型蛍光カルシウム指示薬を用いて活動の変化を蛍光検出します。 Incucyte® Neuroburst Orange Lentivirus 1バイアル：2 mL 4736 SX5、神経科学研究用S3 Incucyte® Neuroactive Orange Kit 1キット 4761 SX5、神経科学研究用S3 神経突起動態 細胞生存率を評価しながら単培養または共培養モデルの経時的な神経突起動態を特性評価します（7ページのAnnexin V試薬 参照） ソフトウェア 96または384ウェルプレートの各ウェル中の神経突起伸長、成熟、障害をラベルフリー解析または蛍光解析できます。 Incucyte® Neurotrack Analysis 1モジュール 9600-0010 SX5、S3、SX1 ソフトウェアモジュール 神経突起標識試薬 シナプシンプロモーターを用いたレンチウイルス試薬は、神経突起の伸長をライブセルで定量化するために、細胞の機能を変え ることなく、標的神経細胞における蛍光タンパク質の均一な発現を可能にします。 Incucyte® Neurolight Orange Lentivirus 2バイアル： 4808 SX5、神経科学研究用S3 各0.45 mL Incucyte® Neurolight Red Lentivirus 2バイアル： 4807 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 各0.45 mL の設定）、S3、SX1 Incucyte® Neuroprime Orange Kit 1キット 4760 SX5、神経科学研究用S3 Incucyte® Neuroprime Red Kit 1キット 4585 SX5（Green/Red Opticalモジュール用 の設定）、S3、SX1 ニューロン細胞 妊娠18日目のSprague Dawleyラット大脳皮質由来の凍結保存細胞です。 Incucyte® rCortical Neurons 1バイアル： 4753 アッセイに応じて異なる 2 x 106細胞 Incucyte® rAstrocytes 1バイアル： 4586 アッセイに応じて異なる 2 x 106細胞 神経突起長（mm/mm²）

浸潤、遊走アッセイ Incucyte®スクラッチアッセイと遊走アッセイでは専用の 備品と自動化ソフトウェアを用いた、遊走と浸潤の連続 - 備品と自動化解析により 生産性を拡大 モニタリングと解析が可能です。 - 最適化したプロトコール、専用 - 画像と動画による細胞運動と形態の確認をインキュベー ター内で完結 直感的な操作でスフェロイドを測定・解析 注目アプリケーション：  スクラッチ遊走・浸潤アッセイ Incucyte® Scratch Wound Analysisソフトウェアモジュールを用いて、 投薬効果による形態学的変化を視覚化しながら遊走・浸潤をラベルフリー で定量的に測定します。 t = 0 t = 2 t = 6 Incucyte® 96-well Woundmaker ToolはIncucyte® Imagelockプレートに培養した単層細胞から全てのウェルで 正確かつ均一にセルフリー領域を作製。Incucyte® Scratch Wound Analysisソフトウェアモジュールを用いて、セルフリー 領域への細胞の遊走を可視化し、リアルタイムで解析。 遊走 浸潤 遊走 浸潤 MCF-7 マイクロプレートグラフはRelative Wound Densityメトリクスを用いて異なる3種類の細胞の特異的な細胞遊走と浸潤の進行を示す。HT-1080線維肉腫 細胞の代表的画像より遊走中と浸潤中の細胞形態における違いは明らかである。