ホワイトペーパー　GxP環境下研究室での生物製剤ロットリリースおよびインプロセス試験の生産性・労働効率の向上

ホワイトペーパー GxP環境下研究室での生物製剤ロットリリース およびインプロセス試験の生産性・労働効率の向上 キーポイント イントロダクション • 生産性向上： QCでの力価サンプルを、ELISAおよびSPR*と比較 バイオレイヤー干渉法（BLI）は、バイオセンサー先端の固相化タン して、それぞれ20～40倍、8～16倍以上、1日に測定することがで パク質層と内部参照層の、2つの表面から反射される白色光の干渉パ きるため、生産性が向上します。 ターンを解析する光学技術です（図1A）。バイオセンサー先端に結合 している分子の数が変化することで干渉パターンがシフトし、その様 • コスト削減： 手動操作の削減により、ELISAに比べて分析者の作業 子をリアルタイムで測定することができます（図1Aと1B）。バイオセ 時間が10倍短縮され、40,000ドル*以上のFTEコスト削減につなが ンサー表面に固相化されたリガンドと溶液中のアナライト間の結合 ります。 は、波長シフトΔλとして測定される光学的な厚みの増加をもたらしま • 操作時間の削減： 堅牢な装置のため、SPRと比較してメンテナン す（図1C）。 スコストを大幅に削減しダウンタイムを低減します。装置は流路 系を使用していないため、サンプルの目詰まりがなく、装置のダ ForteBioのOctetは、BLIテクノロジーを用いて、生体分子間の相互作 ウンタイムが少なくて済みます。したがって、操作を中断しない 用をリアルタイムで測定します。これは抗体および組換えタンパク質 ための2台目のバックアップ装置は必要ありません。 の定量化のためのELISAとHPLCの理想的な代替技術であり、また特に 製品力価ロットリリースアッセイにも適しています。Octetはプレー • 簡単な操作： Octetプラットフォームは、リガンド結合および力価 トベースで流路のないフォーマットであるため、SPRベースの技術と アッセイのメソッドバリデーションにおいて、ELISAおよびSPR*と 比較して異なった利点をGxPユーザーに提供します。Octetは2～96サ 比較して約2倍の速さです。 ンプルの同時測定が可能なため、柔軟でより高いスループットを提供 • 完全なOctet GxPパッケージ： GMP準拠のためのすべての要件 - します。またクルードサンプルの分析能力をはじめとする多様なサン IQOQプロトコルとキット、ユーザーガイド、稼動時適格性確認 プルマトリックスへの耐性があり、より汎用的なサンプル測定が可能 （PQ）プロトコルとキット、監査証跡付き21 CFR Part 11ソフト です。加えて、簡単に使用が可能で、メンテナンス頻度も低く、高い ウェア、ソフトウェアバリデーションパッケージ、バイオセン データ精度であるために、開発プロセス全体を通じてスピードアップ サーバリデーションサポート - を備えています。Octet RED96eお します。Octetプラットフォームは、GxPおよびQCラボに特に適して よびOctet RED384システムには、特に最適化された稼動時適格性 います。 確認キットが付属しています。 • 使用実績： 現在、世界中の複数のCROおよびCDMOで検証され、 使用されています。 * 詳細についてはForteBioにお問い合わせください Reflected Beam Reflected Beam BLI Signal BLI Signal ∆ λ Incident Processing Incident Processing White White Light Light Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm) A B C 図 1: バイオセンサー上の2つの表面からの光の反射パターンの相対的な強度。BLI技術を用いたOctetシステムは、反射光の波長のパターン（Δλ）を測定します。 1 Relative Intensity Relative Intensity Relative Intensity

据付時適格性評価および運転時適格性評価 (IQOQ) IQOQキットは、装置の構成要素のチェックリストと、供給・設置さ れたOctet本体、付属品、およびコンピュータシステムがForteBioの 仕様に準拠していることの文書化された検証、を提供します。また Octet本体が意図した通りに動作することを包括的に文書化した検証 を提供します。これは、光学系、装置のアライメント、プレート、 温度、サンプルプレートの振とう速度などの様々な重要な動作パラ メータが規定の仕様を満たしていることを検証します。IQOQキット は、装置購入時またはOctetの製品寿命の任意の時点で追加すること ができます。ForteBioでは、機器の移動後、修理後、ソフトウェア のアップグレード後にIQOQ手順を繰り返すことをお勧めしていま す。 図 2: ForteBioのOctetシステムは、幅広いスループットのニーズに対応していま す。スループットの高いOctet HTXおよびRED384システムは、それぞれ96また は16サンプルを同時に分析します（上）。Octet K2およびRED96eシステムは、 それぞれ2サンプルまたは8サンプルを同時に分析します（下）。 稼働時適格性評価 (PQ) PQキットは、設置後にOctet本体が完全に機能していることを確認す るために使用されます。システムの機能は、定量分析とカイネティク GxP環境下での分析機器 ス分析の両方についてテストされます。キットには、各分析用の生物 信頼性の高い正確なデータを提供する分析法が、医薬品の製造・発売 学的サンプル、試薬、およびバイオセンサーが含まれており、製品仕 時に品質基準を確実に満たすためには必要です。データの正確性を保 様の範囲内で一貫した再現性のある結果が得られることを実証するた 証するためには、適用される分析機器の性能、使用されるコンピュー めに使用されます。 タシステム、およびデータ取得のために開発された手法が、要求され カイネティクスアプリケーションの適格性評価プロセスは2つありま る仕様を満たしていることが重要です。 す。 GLP（Good Laboratory Practice）、GMP（Good Manufacturing 1 バイオセンサー表面へのリガンド分子のローディングに関する装 Practice）、ISO規格を含むいくつかの公式な規制ガイドラインが存在 置性能を、規定されたローディング許容基準を用いて評価しま　 し、コンプライアンスを満たすためのガイダンスを提供しています。 す。 ForteBioは、ISO 9001認証を取得した企業であり、21 CFR part 11ソ 2 　固相化されたリガンドへのアナライト結合に関する装置性能を、 フトウェアおよびOctet本体用の完全なGxP製品とサービスを提供し 規定された許容基準に基づいて評価します。 ています（図2）。これらは、下記を含みます。 定量アプリケーションの適格性評価プロセスでは、標準基準曲線の作 成に使用される既知濃度の前立腺特異抗原（PSA）の性能を評価しま • Octet CFRソフトウェアおよびForteBio FBサーバは、GxPおよび21 す。アッセイの性能は、規定された許容パーセントの分散の統計量に CFR Part 11規制下の実験室で準拠したデータ収集およびデータ分析 基づいて評価されます。 を可能にする、安全でトレーサブルな電子記録保持のための機能を 備えています • Octetシステムが意図した通りに動作し、性能が仕様を満たしている CFRソフトウェアとソフトウェアバリデーショ ことを保証するIQ/OQ/PQパッケージ ンサービス • お客様の実行によるソフトウェア検証の支援 ソフトウェアのバリデーションと21 CFR Part 11に準拠したソフト • バイオセンサーバリデーション支援サービス ウェアの使用は、GxP環境下で分析機器を使用する前の規制要件で • テクニカルサポートによる支援 す。Octet CFRソフトウェアには、制御されたユーザアクセスや電子署 名などの機能が含まれています。加えてForteBio FB Serverモジュール は、ユーザーセッション中に情報を記録し管理します。ソフトウェア Octet本体の適格性評価 バリデーションは、データ完全性と正確性が常に維持されているとい う確信をユーザーに提供します。ソフトウェアバリデーションサービ 装置の適格性評価は、GxP環境下でアッセイを開発・適格性評価・ スは、Octetソフトウェアが21 CFRパート11の最終規則に準拠してい 検証する分析研究室において、コンプライアンスガイドラインを満 ることを示すことを含め、すべてのソフトウェアコンプライアンスの たすために非常に重要です。ForteBioでは、ユーザーガイド、試 要求を満たすための単一ソースを提供します。このバリデーション 薬、装置の設置と適格性評価に必要な文書を含む、厳格な据付時適 パッケージには、FB Server monitorおよびOctet Data Analysis HTソ 格性評価および運転時適格性評価(IQ/OQ)キットを提供していま フトウェアの機能を検証する方法のための、ガイドラインを提供する す。加えて、稼動時適格性評価および定期的なシステムチェックに 取扱説明書が含まれています。さらに、Octetソフトウェアが生成した 使用できる包括的な稼働時適格性評価（PQ）キットもご用意してい データをMicrosoft® Excel®やGRAPHPAD PRISM™など他のソフトウェ ます。IQ/OQキットとPQキットは、機器の設置時あるいは定期的な アと比較するためのデータセット例を提供しています。 システム性能チェック時などに別途購入し、機器の校正とメンテナ ンスを確認することができます。 2

リード 創薬研究 スクリーニングと リードの最適化と 選択 特性評価 前臨床開発 プロセス開発 品質管理と製造 ハイブリドーマおよび タンパク質の ファージディスプレイ ヒット化合物の 構造機能相関の解明 ライブラリー バリデーション 免疫原性試験 細胞株開発 バイオリアクターの モニタリング スクリーニング オンレート/ 作用機序研究 オフレート アフィニティ 薬物動態/ ランキング マチュレーショ 薬力学試験 細胞培養の最適化 製品力価アッセイ ン ELISA アッセイの エピトープビニング Fc エンジニアリング クロマトグラフィー 開発 試験 ヒト化 の最適化 不純物確認試験 カイネティクスアプリケーション 動的結合容量の Fc受容体 定量アプリケーション 決定 結合アッセイ 図 3: バイオ医薬品開発におけるOctetシステムのアプリケーション分野 高精度の生体分子分析 High Precision Streptavidin 2.0 (SAX2) バイオ BLIはバイオ医薬品の開発と製造において広く採用されている技術で センサー す。Octetプラットフォームのスループットと柔軟性は、主要あるい ForteBio は、厳しいアッセイ精度が要求される下流の創薬や規制環 はスタートアップのバイオ医薬品企業において、医薬品開発ワークフ 境下でのアプリケーション向けに開発されたHigh Precision ローのほぼすべての段階（図3）を加速させ、情報に基づいた意思決 Streptavidin 2.0（SAX2）バイオセンサーを、GxPユーザーに提供し 定をより早く行うことを可能にしてきました。 ています(図4)。SAX2 は、ビオチン化された分子について QC テスト コンプライアンスのための包括的なツールセットは，規制下の品質管 を実施し、ロット内の変動係数（CV）が 4% 以下、ロット間の変動 理（QC）ラボにおいて、上流工程と下流工程の両方で濃度と不純物 係数が 20% 以下という精度管理された仕様を満たしています。SAX2 の分析を行うために、Octetシステムを理想的なものにしています。 は、ビオチン化リガンドを使用するカイネティクスと定量、両方の さらにOctetシステムは、薬物-標的間あるいは薬物-Fc受容体 アッセイに適しています。 （FcγRI、FcγRIIa、FcRIIIおよびFcRn）間の相互作用のカイネティク スおよび力価分析の、またストレス・強制サンプル分解にともなう活 性変化の評価による安定性分析の、ソリューションプラットフォーム となっています。このプラットフォームのハイスループット性と柔軟 性により、バイオ医薬品の一貫した信頼性の高い品質を確保するため の重要品質特性（CQA）の、特定・管理に不可欠な実験計画法 （DOE）を通じて、アッセイ法開発を迅速に完了させることができま す。 バイオセンサーバリデーションサービス メソッドバリデーションプロセス中のGxPユーザーに、ForteBioはバ イオセンサーのサポートを提供しています。お客様はアッセイ方法の 検証およびバリデーションのために複数ロットのバイオセンサーを注 文することができ、将来の購入のためにロットのうちの1つを予約する ことができます。このサービスは下記バイオセンサータイプに対応し ています：Protein A（ProA）、Streptavidin（SA）、High Precision Streptavidin（SAX）、Ni-NTA（NTA）、Anti-Mouse Capture（AMC）。お客様は最大5つの異なるロットを注文することが でき、評価用に各ロットから最大20トレイを注文し、将来の購入のた 図4: ForteBioのHigh Precision Streptavidin 2.0 (SAX2)バイオセンサーパッケー めに最大40トレイを追加で予約することができます。 ジ(PN 18-5136) 3

A B 0.20 4.0 0.16 3.0 0.12 2.0 0.08 1.0 Standard 0.04 Fitting Curve Unknown & Control 0 0 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 50 60 Time (sec) Concentration (µg/mL) 図 5: 既知濃度の組換えインスリンの結合（A）。組換えインスリンの定量のための標準/基準曲線（B）を作成するために使用された。抗インスリンを固相化 したSAXバイオセンサーを試験に使用した。 濃度測定 定量アッセイでは、重要なパラメータである精度、直線性、正確度に ついて、製造で使用するためアッセイが検証されたことを示す必要が Octetプラットフォームは、抗体やタンパク質の濃度を測定するため あります。加えて、アッセイ性能に対する信頼性を高めるため、定量 の便利で信頼性の高い分析法を提供します。シンプルなDip and 限界（LOQ）を決定すべきです。一例として(ref１)、組換えインスリ Read™アプローチは、合理化されたワークフローを可能にし、Octet ンの濃度定量方法の精度と正確度を決定するために、Octetシステム HTXシステムではわずか5分で96サンプル、Octet RED96eシステム が使用されました。High Precision Streptavidinバイオセンサー では30分以内に80サンプルを、迅速に定量することができます。サ （SAX）は抗インスリン抗体でコーティングされ、精製インスリンサ ンプルは細胞培養上清または複合培地中で分析できるため、精製の ンプルを結合するために使用されました。濃度既知のインスリンサン 必要がありません。 プルをForteBioの1X Kinetic Bufferで0～50μg/mLの濃度で調製し、結 典型的な定量アッセイでは、キャプチャー分子でコーティングされた 合アッセイ（図5A）に使用して標準/参照曲線を作成しました（図 バイオセンサーをプレート内のサンプルに浸し、リアルタイムでオン 5B）。3つのインスリンサンプル(25、6.25および1.56μg/mL)も1X レートを測定します。測定されたオンレートは標的タンパク質の濃度 Kinetics Buffer中に添加され、未知濃度のサンプルとして処理されま を決定するために使用されます。これは、標準曲線作成に使用した既 した。すべてのサンプルは3回繰り返して測定されました。データ 知濃度アナライトのセットから得られた結合シグナルと、未知サンプ は、Octet Data Analysisソフトウェアの初期勾配結合率分析モードを ルからのシグナルを比較することによって行われます。抗体およびタ 使用して解析しました。標準サンプルは3%未満の濃度％CV（表1）、 ンパク質の濃度決定に一般的に使用されるバイオセンサーに また未知濃度サンプルは5%未満の濃度％CVを示し、優れた精度を示 は、Protein AおよびProtein Gバイオセンサー、抗体またはFcベース しました。未知試料の回収率は90-110%以内であり、優れた正確度を タンパク質分子用のAnti-Human IgG（AHQ）およびAnti-mouse 示しています（表2）。他の組換えタンパク質についても同様のアプ IgG（AMQ）バイオセンサーなどがあります。Anti-HIS (HIS2)、Anti- ローチが可能です。 GST (GST)およびHigh Precision Streptavidinバイオセンサー (SAX) は、組換えタンパク質の定量に使用されます。Octetは相互作用する 分子ペアのユニークな結合特性を測定しますので、OD280測定のよう な技術で使用される外部標準物質による校正は必要ありません。装置 の性能は、システムが設定された仕様範囲内で動作していることを確 認するために使用可能な、よく特徴付けられた材料により検証されて います。特定の相互作用ペアの結合特性はそれぞれユニークなため、 適合するマトリクス中の精製アナライトを使用した標準または参照曲 線が必要となります。結合イベント中の結合曲線がサンプル中のアナ ライト定量に使用されるため、バイオセンサー上の固相化リガンドに 本当に結合する生体分子の量のみが測定されます。 4 Binding (nm) Binding (nm)

Conc. Binding rate, Conc. avg, µg/ Conc. % 安定性および強制分解試験 µg/mL nm/s mL CV Octetプラットフォームは安定性確認の手法を開発するために使用す 50 1.02 50 2.39 ることもでき、完全に機能する医薬品と、分解によって結合活性が 影響を受けた医薬品を、測定し区別するのに適しています。ある試 25 0.5 25 1.88 験でOctetプラットフォームは、ネイティブ抗原と不活化抗原を区別 12.5 0.1872 12.5 1.24 するために使用され、結果不活化抗原の結合活性の低下を示し （ref3）、それ故にこのアッセイで安定性が示されることを証明して 6.25 0.0611 6.2 1.48 います。別の試験（ref4、図7）では、FcγIIIa受容体分子に対する 3.13 0.0189 3.1 0.3476 IgG1の親和性は脱グリコシル化率の増加に伴って減少することが示 されており、安定性確認の手法を開発するためにOctetシステムを使 1.56 0.0058 1.6 2.83 用することが適していることをさらに示しています。 0.78 0.0012 0.8 0.2831 0 0.0001 0 0 表 1: インスリンの濃度定量。標準試料はCV値が<3%の優れた精度を示します。 Association Dissociation .60 Conc. Binding Conc. avg, Conc. % % .50 µg/mL rate, nm/s µg/mL CV Recovery .40 25 0.5182 25.9 1.41 104 6.25 0.064 6.4 0.1638 102 .30 1.56 0.0066 1.7 1.4 106 .20 表 2: インスリンの濃度定量。濃度未知試料(n=3)は優れた精度と正確度を示し .10 ます。 0 0 20 40 60 80 100 Time (sec) 高精度のリガンド結合アッセイおよび力価測定 図 6: OctetプラットフォームとFAB2Gバイオセンサーを使用した、FcRn-IgG相互 作用の再現試験の重ね合わせ。データトレースのフィッティングは、グローバル リガンド結合カイネティクスアッセイは、バッチロットリリースの方 フィッティングと5秒の解離ステップで1:1モデルを使用して行われました（赤線: 法として使用されることが多くなってきており、特に製品の安定性や フィッティングした曲線）。 機能性を評価可能である力価測定として使用されています。これらの 結合カイネティクス研究では、バイセンサー表面に固定化された受容 体やリガンドに対するアナライト/医薬品の親和性を測定したり、あ 1.6E-6 るいは濃度の関数として医薬品の結合応答シグナル（Req）をモニ ターし対照品と比較することで相対的力価を評価したりして、相互作 用を評価することがよくあります(ref2)。ForteBioは、力価評価のた めに医薬品を結合させる様々なFcガンマ受容体を固相化するため 1.4E-6 の、Ni-NTAやFAB2Gバイオセンサーなど、すぐに使用できるバイオ センサーを提供しています(ref3)。 いずれの場合も、精度と正確度の再現性が重要な測定基準となりま す。Octetシステムは、SPRやELISA法に比べてメソッド開発時間を 1.2E-6 大幅に短縮できるため、これらのアッセイに非常に適していま す。IgGをAnti-Human Fab-CH1（FAB2G）バイオセンサーに固定化 した場合、FcRn分子とIgGの結合に関する再現実験のデータを重ね合 わせると（図6）、優れた再現性を示しています。 1.0E-6 R2 = 0.9883 8.0E-7 0 20 40 60 % Deglycosylation 図 7: 脱グリコシル化による、IgG1とFcγ受容体との結合アフィニティ変化の 解析 5 KD (M) Binding (nm)

技術サポート Item Description ForteBioは、GxP環境でのOctetユーザーに包括的な技術サポートと IQOQキットと 装置コンポーネントの検証及び文書化に サービスサポートを提供しています。フィールドアプリケーションサ サービス 必要な項目、及び装置の稼働性能の適格 イエンティストとエンジニアは、アッセイ開発と適格性評価を含む 性評価の確認に必要な項目が含まれてい 様々な側面のコンプライアンスについてガイダンスを提供するために ます。 訓練を受けています。装置の予防的保全と必要な文書を含む性能認証 PQキット 結合の仕様および定量化アプリケーション （PC）もGxPユーザーに提供されており、これは6ヶ月ごとに推奨され に、装置の性能が適合していることを確認 ています。 するために必要な、バイオセンサーおよび 試薬が含まれています。 まとめ CFRソフトウェア 21 CFR Part 11 規制へのコンプライアンスを 確実にするData acquisitionとData analysis ForteBioは、規制空間でのコンプライアンスを確実にし、GLPおよび ソフトウェア QC研究室での様々なアプリケーションに対応したアッセイ法の迅速な ソフトウェア ForteBioは、Octetソフトウェアの検証中に 開発、最適化およびバリデーションを可能にする、完全なクオリフィ バリデーション ユーザサポートを提供しています。 ケーション、バリデーションおよびサポートソリューションをOctet サポート ユーザーに提供しています。提供している製品と推奨分析法の概要を バリデーション アッセイ方法の適格性評価およびメソッ 表 3 に示します。 支援用バイオ ドの検証プロセスにおいて、ForteBioは センサー お客様と協力して複数のロットのバイオ センサー（特定グループのバイオセン References サー選択用）を取り置きします。 1 Steve Turner et al., ForteBio Application Note 22: Customized Quantitation Octetプラット ロットリリース試験、インプロセス試験お of Recombinant Therapeutic Proteins Using High Precison Streptavidin フォームで推奨 よび治験薬（IND）試験アッセイ、力価アッ (SAX) Biosensors. される主要なGxP セイ、リガンド結合試験、安定性試験、検 2 Nathan Oien et al., KBI Potency webinar: From Screening to QC: Develop- アプリケーション 出限界および力価決定方法。 ment considerations for Octet methods. 3 Michael Sadik et al., Bioprocessing Online, Accelerate Biopharmaceutical 表 3: ForteBio Octetプラットフォームの提供するGxP製品と典型的な Development with Novel Analytical Techniques, April 28th, 2017. GxP/QCアプリケーション。 4 Renee Tobias et al; ForteBio Application Note 19: Analysis of FcRn-Antibody Interaction on the Octet Platform. ザルトリウス・ジャパン株式会社 〒140-0001 東京都品川区北品川1-8-11 Tel: 03-6478-5200　Fax: 03-6478-5494 E-mail: fortebiojp@sartorius.com © 2020 Sartorius BioAnalytical Instruments, Inc. All rights reserved. ForteBio and Octet are trademarks of Sartorius AG and/or any of its affiliated entities. Specifications subject to change without notice. For Research Use Only. WP-41-0293_J Rev E